产品说明书：

https://www.qa-bio.com/docs/KE-DG01.QA-Bio.specsheet.pdf

产品规格

单独使用适当的糖苷酶能够确定唾液酸化情况（仅使用唾液酸酶）、N - 连接聚糖的具体存在情况（仅使用PNGase F）以及O - 连接聚糖的具体存在情况（使用唾液酸酶、β - 半乳糖苷酶、O - 糖苷酶和葡糖胺酶）。

产品包含：

Ludger酶促糖释放试剂盒包含：

包含分别装于不同小瓶中的每种酶20微升：

PNGase F（脑膜炎败血伊丽莎白金菌）、

O - 糖苷酶（肺炎链球菌）、

唾液酸酶（尿素枝孢菌）、

β - 半乳糖苷酶（肺炎链球菌）、

葡糖胺酶（肺炎链球菌）。

还包括：

5倍反应缓冲液 - 200微升

变性溶液 - 100微升

Triton X - 100 - 100微升

牛胎球蛋白（对照物） - 10毫克/毫升

特异性：

酶促糖释放试剂盒将对糖蛋白进行去糖基化，去除糖蛋白上所有的N - 连接寡糖和许多O - 连接寡糖。N - 连接（天冬酰胺连接）寡糖使用PNGase F酶去除。此外，所有的丝氨酸或苏氨酸连接（O - 连接）的Gal - (β1 - 3) - GalNAc - (α1)以及所有被唾液酸取代的Gal - (β1 - 3) - GalNAc - (α1)将使用唾液酸酶和O - 糖苷酶组合去除。添加β - 半乳糖苷酶和葡糖胺酶有助于对较大的O - 连接结构进行去糖基化。

试剂盒容量：

按照方案中推荐的酶用量足以在给定时间内对大约100微克的平均糖蛋白进行去糖基化。由于某些空间位阻较大的N - 连接残基即使糖蛋白变性后去除速度也较慢，PNGase F的切割通常是限速反应。由于所有酶在反应条件下可保持活性数天，如果延长孵育时间，可以对更多的糖蛋白进行去糖基化。相反，如果要裂解的糖蛋白量远少于100微克，则无需使用推荐量的酶。这些酶可稀释到1×反应缓冲液中，在4℃下稀释状态下仍然稳定。

牛胎球蛋白对照蛋白：

牛胎球蛋白含有唾液酸化的N - 连接和O - 连接寡糖。

注意：市售的胎球蛋白含有蛋白酶，最终会降解该蛋白。胎球蛋白对照物已在90℃下热处理10分钟以使蛋白酶失活。胎球蛋白溶液可在4℃下储存。

变性方案：

1. 在一个Eppendorf管中，将100微克或更少的糖蛋白溶解于30微升去离子水中。

2. 加入10微升5×反应缓冲液和2.5微升变性溶液，轻轻混合。

3. 在100℃下加热5分钟。

注意：某些蛋白质与SDS一起加热时可能会沉淀。如果出现这种情况，省略热处理步骤，并在加入酶后将孵育时间延长至24小时。

4. 冷却至室温，加入2.5微升Triton X - 100溶液，轻轻混合。

注意：如果不添加Triton X - 100，可能会导致某些酶的活性降低。

5. 分别加入每种酶各1微升。

6. 在37℃下孵育3小时。

7. 使用所选方法进行分析。

或者，可以单独或依次添加这些酶，以确定糖蛋白上存在哪些类型的寡糖。

非变性方案：

1. 在一个Eppendorf管中，将100微克或更少的糖蛋白溶解于35微升去离子水中。

2. 加入10微升5×反应缓冲液。

3. 加入每种酶各1微升。

4. 在37℃下孵育1 - 5天。

应使用变性方案对一份样品进行去糖基化处理，为完全去糖基化的蛋白质提供一个凝胶标准品。然后将天然蛋白质的位置与该标准品进行比较，以判断去糖基化的程度 。